片上實驗室的新進展

2004年8月A版

　　當前，半導體集成技術終于轉向了90nm線寬工藝，開始進入納米領域，預料今后將再發展65nm、45nm的細微加工技術，人類擁有的細微加工技術將真正達到納米技術的水平。把這種納米技術應用到生物化學領域目前極受關注。

何謂片上實驗室

　　近年來，把科學的分析操作集成到像半導體集成電路那樣的幾個平方厘米的玻璃、硅或塑料等微型薄片上的研究正在蓬勃開展，這在美國叫做片上實驗室(Lab-on-a-chip),在歐洲稱為MTAS(Micro Total Analysis Systems,微型綜合分析系統)。它是指利用細微加工技術在玻璃或塑料基板上制作成溶液流動的微小通道網絡，在一只芯片上集成如在實驗室進行生化、化學操作和檢測。

　　由于其微小，必然具有樣本微量化、反應與分析高速化等多種優點。其方法雖各有不同，但就其根本目的來說，進行的納米級的化學及生物高分子等的性質和功能分析，或者對其人工合成與控制則是共通的。為此，今天已應用了納米技術。

片上實驗室與納米技術

　　關于應用納米技術及反應場微小的效果包括：①因擴散而易于產生混合，即反應場體積如為1/10，則擴散時間將縮短為1/100；②提高每單位體積的表面積比，這可望熱的進出及表面-液體間的相互作用(包含催化劑化學反應等)高效化。③提高通道每單位截面積的周長比；由于壁面與液體的粘著力的影響比慣性力增加更大，故通道中的液體易形成層流。

　　目前主要是利用①、②效用研究通道中液體與液體界面化學處理，但如能通過納米表面結構加工等納米技術進行控制，則可望利用②的效用，開發固體、液體表面反應高效化的反應堆。此外，由于nm級的空間控制可實現微小空間的精密環境控制，故有可能發展如設計生物分子之類的制作技術。

　　此外，如考慮到nm大小的蛋白質或其集合體(生物分子機械、生物納米機)負有生命的功能，則必須測量單個分子或單分子機械的功能，直接觀察、操作這一測量的技術已在開發中。

片上實驗室對染色體分析的必要性

　　包含人的遺傳基因信息的全部DNA信息(堿基系列)的人類染色體排序已接近完成。人類染色體計劃由于DNA排序技術的顯著進展，將比預定期限更短成功實現(圖1)。人類已處于后染色體時代的起點。

　　即使在后染色體時代，染色體及DNA分析仍然重要。分析每個人染色體信息差異的SNP分析，分析比較人以外生命的染色體信息來深刻理解生命現象的比較染色體學等，都必須由龐大的樣本和信息進行歸納或演繹分析，因此，更高速的DNA排序技術將是不可缺少的。近年來大受重視的按染色體制藥實現的定制式醫療，就需要各個人的染色體分析。

　　人染色體有約32億個堿基，1000人的染色體信息就會有3T個(T=1012)堿基，地球規模計人染色體信息將是18E(E=1018)的天文數字。要獲得這樣龐大的信息現有技術將受到限制，只有前所未有的嶄新技術才有望在后染色體排序時代發揮極為重要的作用。

　　作為把握下一代技術開發關鍵的基礎技術，基于半導體技術的微納米技術與提取生命信息的濕化學技術的結合、陣列排布和集成最為重要，片上實驗室在目的及技術方面將是所追求的，也必將應用于染色體分析。在這一背景下，便出現了應用細微加工技術的DNA芯片及電泳芯片等獨特的微芯片DNA分析技術。

DNA芯片與微陣列

　　DNA芯片是把序列各異的許多(幾千至數萬種)DNA片斷排列固定在玻璃或硅基片上，以預先用螢光試劑標準化的DNA樣本擦該芯片，利用作成DNA互補的雙層螺旋狀的性質，用激光束檢測樣本DNA與DNA芯片上的某種DNA是否產生相互作用(雜混)。

　　DNA在芯片上的固定大致分為化學結合型和定位型兩類。通常，把化學結合型叫做DNA芯片，而把定位型叫做微陣列。

　　DNA芯片及微陣列最重要的應用領域是遺傳基因的顯現分析。在人染色全中，遺傳基因總共有3~4萬種，其中實際起作用(顯現)的遺傳基因只有一部分，而且不同的細胞其顯現遺傳基因不一樣。比如，比較癌細胞與正常細胞，若研究癌細胞中經常顯現的遺傳基因或不顯現的遺傳基因，其中就應該有把握致癌機理關鍵并成為治療對象的遺傳基因。若知道遺傳基因，便可望大規模進行疾患的診斷和治療了。

　　遺傳基因顯現分析情況下，要知道遺傳基因的顯現，必須知道顯現生成的RNA(傳遞核糖核酸)。首先從細胞中取出mRNA，利用逆復寫反應配制加入了螢光標識的目標cDNA(互補DNA)。將該cDNA雜混在微陣列中，使可用螢光成像分析器檢測出來。例如，根據人癌細胞與正常細胞的微陣列分析結果，可以發現兩種細胞間遺傳基因顯現量的不同，通過對它們的數據庫檢索，便能發現癌細胞中經常顯現的遺傳基因。

微芯片電泳

　　DNA的排序方法一般采用圣伽法。圣伽法中DNA片斷的分離最初通過平板型聚丙烯酰胺凝膠電泳實現。它是在兩塊玻璃板間用凝膠作隔離物。但是在人染色體計劃中，取代該分離法利用毛細管電泳進行處理，實現了處理速度的飛躍提高。

　　現在還開發了在微芯片上的通道中實現染色體排序的技術，證明20分鐘即能實現每個通道中解讀600堿基的遺傳信息。此種微芯片排序器能達到現有DNA分析設備1000倍以上的高速度，是一種極具魅力的新技術。

　　圖2示出微芯片電泳的概念。首先，在所有流路及各貯液槽(圖2中a凝膠貯液槽)中注入泳動緩沖液。其后在樣本貯液槽中加入樣本，如圖2(b)加上電壓，在幾十秒內樣本DNA將均勻充滿樣本引入流路。然后如切換所加電壓(圖2(c))，存在于流路接頭部的一定量的樣本將移動到分離流路，利用電泳進行分離、檢測。此時，由于留在樣本引入流路內的剩余樣本遠離流路接頭部，對外部的貯液槽仍加正電壓，如圖2(d)。

　　圖2右邊是使用了3種DNA混合溶液對該樣本引入情況的成像。在樣本引入1秒鐘后DNA呈極尖銳的的帶狀進入分離通道，到6秒鐘后便看到3種DNA帶狀物開始分離，由于這種樣本引入法的采用，與毛細管電泳不一樣，能達到定量的樣本引入。

DNA單分子分析的挑戰

　　利用微芯片電泳之各種方法雖能進行DNA排序的高速化，但如考慮將來染色體醫療等后染色體研究(參見圖1)，必須有提取龐大達E級的堿基序列信息的排序技術。為實現DNA排序的全新高速化，正在挑戰DNA單分子分析，目前雖在研究階段，但研究甚為活躍。試舉意味深品的一例。

　　據哈佛大學的Branton等稱，已試驗過DNA單分子通過納米的排序，由D-溶血素葡萄球菌的蛋白質毒素)自身作用形成直徑1.4nm的納米孔，在具有此種納米孔通道的脂質雙層膜兩邊加電壓，此時電解質在溶液中溶解，由于通過納米孔的離子傳導，便有微微安級電流流過。當帶負電的DNA分子被拉向陽極時，堵塞了作為離子通道的納米孔，離子傳導受到限制，從而檢測出電流值的改變。

　　根據通過的堿基種類A、T、C、G產生的電流值變化，便可實現排序。由于DNA分子的毫秒級通過納米孔，基實現就可能達到高速排序。迄今已在聚腺嘌呤與聚胞嘧啶之間發現了電流值變化的差異。但為了排序，還需要靈敏度更高的檢測器等，尚有許多必須改進之處。

走向高度集成系統

　　所介紹的電泳芯片已開始有設備出售了，微芯片技術為了更大提高處理能力，正在發展成為把從細胞的DNA提取、PCR(聚合酶連鎖反應)等反應、電泳、雜混、激光誘發螢光檢測、電化學檢測、熱透鏡顯微鏡檢測等染色體分析所必需的所有基本處理，集成到幾平方厘米的微芯片上的集成型微芯片。

　　而且，隨著集成化技術的急速進步，細微加工將從微米領域轉向納米領域。代替過去用作DNA分離媒體的凝膠和聚合物，而把采用納米細微加工技術作成的納米柱配置在微通道中，實現不同凝膠或聚合物的DNA及蛋白質的分離，開發出微芯片上具有各種納米結構的器件，并實現極微量或單分子DNA或蛋白質提取、放大、排序、多項檢測等集成化超高速分析技術。這樣的納米芯片技術也在進行研究。

　　DNA分析中各種處理迄今都進行了高速化的研究，但通過如圖6所示把所有處理微化、集成在同一芯片上，由于能激劇縮短各處理花費的時間，便可望使整個過程大大高速化，這才將真正進化到“片上實驗室”。(蔡)