利用RRLC改善西洋參HPLC的分離速度和靈敏度
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概述
西洋參（又名花旗參）系五加科植物西洋參（Panax quinquofolimm L.）的干燥根，西洋參的根部及地上莖葉部分含有多種生理活性成分，其中主要是西洋參皂甙和三萜類化合物，三萜類化合物與人參皂甙結構相似。西洋參皂甙是西洋參中主要的有效成分，也是生理活性最顯著的物質。其中人參皂苷的Rb1又是西洋參主要特征成分，其含量高于人參，也是西洋參與人參鑒定的主要依據。
在2005版中國藥典一部中，西洋參活性成分的含量測定采用了以十八烷基鍵合硅膠為填料、以乙腈和0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫的液相色譜分析方法。該方法主要需要分離人參皂苷Rg1、Re與Rb1，因3個化合物結構相似，尤其是Rg1和Re（見圖1），故HPLC需要利用長時間的淺梯度分離。3個色譜峰的HPLC分離時間需要約60min，分離一次的運行時間長達120min。本研究是在中國藥典HPLC梯度方法的基礎上，選擇合適的鍵合相填料，開發以小顆粒填料技術為基礎的RRLC方法，在滿足分離度要求的前提下，實現快速、靈敏、可重現的方法學目標。
圖1 人參皂苷的結構
RRLC方法轉換和優化
快速高分離度液相色譜（RRLC， Rapid Resolution Liquid Chromatography）利用亞二微米小顆粒填料分離的液相色譜技術，與常規較大顆粒（如5mm）不同，小顆粒可以顯著改善液相色譜的分離度、分離速度和靈敏度。因RRLC分離常常使用與HPLC不同的儀器和色譜柱，故在RRLC分離時需要對原始HPLC分離條件進行適當的調整或優化。
色譜柱的選擇
因流動相中含有磷酸，RRLC分析采用內含1.8小顆粒的ZORBAX StableBond C18色譜柱。該填料在低pH條件下具有杰出的穩定性，是低pH條件液相色譜分離的首選。色譜柱規格選擇了4.6×50mm的RRHT色譜柱，其柱長與粒徑之比（L/dp≌28）與規格為4.6×150 mm， 5的常規HPLC色譜柱相當（L/dp=30），故可以獲得相近的分離效率，但分離速度大大提高，并且可以改善靈敏度。
色譜柱內徑的選擇主要考慮方法轉換的方便性，選擇與HPLC色譜柱相同內徑的RRHT色譜柱可以降低方法轉換的可變性。本方法采用了與HPLC色譜柱相同內徑（4.6mm）的RRHT色譜柱。如選用更小內徑的色譜柱，可以在保持線速度相同的前提下獲得相同的分離結果，并進一步降低溶劑消耗。
方法轉換的初步參數確定
在Method Translator相應欄目中輸入原始HPLC條件，包括HPLC色譜柱規格、進樣量、流速、梯度表等參數，并選擇RRLC色譜柱的規格，即可獲得根據洗脫柱體積相同原則折算而得的RRLC分離的初步參數。
因小顆粒填料在較高的線速度下可以保持柱效（分離度），故可以通過提高流速的方式進一步提高分離速度。如需保持分離度相同，則在流速調整時要保持流速與梯度時間乘積不變，即提高流速的同時等比縮短梯度時間。本研究根據中國藥典一部中給定的西洋參梯度分離條件和上述原則，確定了初始實驗條件。
方法優化
起始試驗條件雖然獲得了與藥典原始HPLC方法相似的RRLC分離譜圖，但因色譜柱選擇性的差異等影響，并沒能基線分離結構相近的目標化合物Rg1與Re。因此，方法需要進行進一步摸索與優化。適當降低流動相在Rg1與Re出峰附近的洗脫強度，兩色譜峰的分離度獲得了初步改善，但仍未實現基線分離。考慮到溫度對分離選擇性的可能影響，嘗試設置不同柱溫考察分離選擇性的變化。原始中國藥典的方法所用柱溫為40℃，本實驗在原始條件的基礎上，又分別在25℃和30℃下進行了分離（見圖2）。
圖2 不同溫度下，Rg1與Re的分離度比較
圖3 西洋參中人參皂苷的RRLC分離結果
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