ACS Synthetic Biology丨開發人體腸道擬桿菌的基因組編輯新工具

團隊成員鄭靈剛和譚揚為共同第一作者，該工作得到了國家重點研發計劃合成生物學重點專項青年科學家項目（No.2019YFA0906700）與深圳合成生物學創新研究院的資助。   腸道擬桿菌屬是腸道中豐度最高的細菌之一（如圖1所示），被視為研究腸道微生物組的“窗口”。


擬桿菌屬與多種疾病相關，比如肥胖，炎癥性腸病和結直腸癌等，其中多形擬桿菌和脆弱擬桿菌最為受到關注。基因組編輯工具對于研究腸道共生微生物的功能至關重要。因此，該團隊設計了針對人體腸道擬桿菌的多功能、高效的 CRISPR/Cas 編輯工具（如圖2所示）。
 該團隊在擬桿菌屬中測試了不同的CRISPR/Cas系統。主要評估了啟動子，Cas蛋白（SpCas9，SpRY，和FnCas12a），gRNA等元件，以及不同質粒的系統對于擬桿菌屬基因編輯的影響。并發現在多形擬桿菌中采用正常組成型啟動子表達Cas蛋白，CRISPR/Cas系統無法實現編輯，但是使用誘導型啟動子表達Cas蛋白，均可以實現基因編輯；其中FnCas12a效果最好。基于此，團隊測試該系統在多形擬桿菌中可以實現5kb、10kb、48kb基因簇片段的刪除和外源基因GFP的高效插入。此外，也可通過在無篩選標記的培養基中傳代，進行含有篩選標記的質粒的丟失，實現獲得“無篩選標記（markerless）”的突變株（如圖3所示）。
 除此之外，該系統也可以在卵形擬桿菌（Bo），脆弱擬桿菌（Bf），普通擬桿菌（Bv），和單形擬桿菌（Bu）實現高效率的基因刪除。（如圖4所示)
 與之前針對擬桿菌屬基因基因遺傳操作工具相比，該團隊基于CRISPR/Cas系統的工具極大的提高了擬桿菌屬基因編輯的效率，同時也更容易實現無篩選標記突變株的獲得。高效、精準的基因組編輯方法對于解析腸道微生物組的功能、開發工程腸道益生菌都是不可或缺的工具。
文丨鄭靈剛編輯丨趙梓杉