一招變身檢測熒光達人

　　檢測熒光方法和手段根據不同的實驗要求和目的也多種多樣，使用最多的還是熒光顯微鏡，熒光酶標儀，流式細胞儀等。但是，無論何種儀器，無論儀器的性能如何，要得到準確的實驗結果，準確的實驗數據，最基本的條件就是根據所使用的熒光染料正確設置激發和發射波長。

　　下面我們以熒光顯微鏡的熒光濾色鏡為例，介紹一下濾色鏡組的構造以及根據染料，如何正確選擇濾色片。

　　熒光激發塊是熒光顯微鏡中用來激發熒光標本和觀察熒光的核心部件，它實際是濾色片的組合，一般含有3種濾色片：

　　1. 激發濾色片（Exciter Filter）：選擇透過某個波段的光，來激發熒光染料。

　　2. 分色鏡 （Dichroic Mirror）：反射激發光，透過熒光，一般激發光波長短，而發射光波長較長。

　　3. 發射濾色片（Barrier Filter） ：透過發射光，也就是我們看到的“熒光”。同時阻擋各種雜散光和激發光的反射光。

　　根據熒光觀察的原理——熒光染料吸收特定波長的光（即激發光），躍遷到激發態，然后再釋放出特定波長的發射光（即熒光），回到基態。由此可知熒光染料所需的激發光和釋放的熒光都是特定波長的，所以需要利用各種濾色片來選擇性的透過某種特定波長的光來實現熒光觀察。否則，就會出現激發不了，激發了卻看不到或串色的現象。所以選擇合適的濾色片非常重要！

　　下面我們以熒光染料DAPI為例，闡述該如何選擇熒光激發塊。

　　通過上圖，我們可以了解到DAPI的激發光波長為300nm-410nm左右，激發峰值在360nm左右，也就是說激發光在300-410nm時可以激發DAPI染料，在360nm時激發效率最高。發射光波長為390nm-600nm，峰值在470nm左右。接著，我們就根據這些數據來選擇濾色片。

　　上圖為Olympus U-FUW激發塊的光譜信息。我們可以了解到此激發塊可以提供的激發光波長在300-400nm之間，剛好可以激發DAPI。允許透過的熒光光譜范圍也在410nm以上，所以此激發塊可以用來實現DAPI熒光染料的觀察。