哈佛團隊開發小分子化合物篩選新策略，可直接靶向非編碼RNA，專家解讀：成****還有很長的路要走

一直以來，蛋白質類靶點在傳統小分子****物中占據著絕對的領導地位，盡管人類基因組中 98% 的 核苷酸序列產生的RNA 并不會翻譯為蛋白質。也就是說，即使整個蛋白質組中僅有一小部分可以作為****物的靶標，RNA 也并未成為****物開發選擇的主流靶標。業界普遍認為，以具有穩定形狀和構象的蛋白質為依據開發相應的****物更為安全、有效。

然而，隨著越來越多的疾病被歸因于非編碼 RNA，以及科學界對 RNA 的研究不斷加強，以 RNA 作為靶點的可行性不斷被證實。近 10 年來，以 RNA 作為靶標進行小分子****物開發的****企也逐漸增多。

哈佛醫學院遺傳學教授 Jeannie Lee 表示，“非編碼 RNA 在基因組中發揮著非常重要的作用，我們了解到，非編碼空間中的突變會導致疾病，而且非編碼 RNA 的數量可能遠遠多于蛋白質編碼基因。如果有能夠靶向這些 RNA 的方式，將極大擴展我們可以找到治療患者****物的領域。”

不過，目前全球獲批上市的靶向 RNA 的小分子****物仍是屈指可數。其中， 2020 年 FDA 批準上市的脊髓性肌萎縮癥****物 evrysdi，為首個獲批上市的靶向 RNA 的小分子****物。

然而，“當前已經證明可以靶向 RNA 的小分子****物如 evrysdi、linezolid、ribocil、branaplam 等都是通過表型篩選的手段發現，后續通過實驗證明是靶向 RNA。”ReviR（溪礫科技）聯合創始人、董事長李陽博士告訴生輝。

可以說，對于加快靶向 RNA ****物的發現尚需一種可擴展的、直接發現靶向 RNA 的化合物分子篩選方法。對此，Jeannie Lee 團隊開發了一種可直接篩選靶向非編碼 RNA 的小分子化合物的策略，并且他們使用該方法證明了篩選出的小分子化合物可與名為 Xist 的非編碼 RNA 結合。相關論文于近日發表在 Nature 上。

（來源：Nature）

“該研究的關鍵突破是找到并且證明了一種新的靶向 RNA 小分子化合物的篩選方法，而且，他們證明了這種小分子化合物是直接作用于 Xist 的，而非其所表達的蛋白。”新加坡國立大學醫學院助理教授史家海告訴生輝。

非編碼 RNA Xist 是一種使X染色體失活的關鍵分子，Xist 上富含 GC 序列的區域 RepA 主要負責基因沉默，RepA 異常導致X 染色體未失活將引發相應的遺傳疾病。

在 Jeannie Lee 團隊驗證其設計的篩選靶向 RNA 的小分子化合物方法中，以 Xist 為靶點展開，并且為首個靶向Xist化合物的高通量篩選方案。

該團隊基于親和質譜技術設計了一種無偏方法，使用已應用于蛋白質篩選的 ALIS 系統進行靶向 RNA 的小分子化合物篩選，這一系統可自動識別親和力大于 10μM 的可逆性結合配體。

具體而言，該團隊利用這一方法在默克的包含 5 萬種小分子化合物的文庫中進行篩選，發現了 20 個表現出合理****物特性的化合物，有 15 個展現出了與配體較強的親和力。

其中，具有吲唑-苯并咪唑支架獨特構象的化合物 X1 為與配體結合親和力最強的一個，且對 RepA 具有高度的特異選擇性。

為進一步驗證其篩選出的化合物 X1 對 RepA 功能的影響，該團隊將 X1 與促進 Xist 傳播、沉默 X 染色體的同源蛋白 RepA RNA、PRC2 以及 SPEN-RRM 的相互作用進行了檢測。測試結果顯示，在 X1 的作用下，RepA 與同源蛋白之間的相互作用逐漸受到影響（下圖f）。并且，相互作用的希爾系數為 1.4-1.5，這表明 X1 在影響 RepA 功能過程中可能會發揮協同作用，即不止一個 X1 分子與 RepA 結合。

（來源：Nature）

“這一研究表明，通過高通量手段直接篩選 RNA 結合的小分子已經可以實現。”李陽說道。

對于這項研究發現，李陽總結了兩個重要的意義：

第一，小分子靶向 RNA 被證明可行。“而且這次他們選擇的是非編碼 RNA 作為靶點來篩選化合物，預示著非編碼 RNA 也能成為制****靶點來開發****物，更加拓寬了 RNA 制****領域的范圍，將使得傳統認為不可靶向的靶點可以進一步被挖掘。”李陽說道。

就現階段而言，溪礫科技也已經開始針對 ncRNA 以及 mRNA 靶點進行小分子****物篩選。

第二，表明了可以通過一些高通量手段來直接篩選 RNA 結合的小分子，其他的如 DNA 編碼化合物庫（DEL）也逐漸被應用。

對此，復旦大學生物醫學研究院于文強教授也表達了類似的觀點。他表示這篇研究主要貢獻在于證明了小分子靶向 RNA 的可行性，“其采用一種小分子****物，來打開或改變 RNA 的二級結構，換句話說，RNA 序列雖然結合在位置上，但是后續因為小分子干預導致二級結構變化而沒有相關蛋白質的結合，最終也發揮不了作用。”

（來源：Pixabay）

人類基因組中的絕大多數 RNA 是非編碼的，非編碼 RNA 的不穩定性使得制****公司不愿意開發靶向它的****物。于文強則認為，“并非因為非編碼 RNA 不穩定而不去開發****物，非編碼 RNA 作為****物的靶點，其主要問題是機制和下游靶點十分不明確，而且毒性太強，盡管該問題目前已經得到部分解決。”

據介紹，在制****領域，相較于以蛋白質作為靶點進行****物開發，將 RNA 作為靶點存在一些不足，比如，RNA 結構相對蛋白質簡單，需要解決靶點特異性問題；而且小分子與 RNA 靶點結合較弱。

當然，將 RNA 作為靶點也有優勢，比如蛋白層面不可成****靶點可以被靶向，同一個基因存在多個潛在 RNA 靶點，并且存在大量可成****機制可以被探索，如 ribotac。

關于****物靶點的選擇，李陽指出，其與具體機制相關，一些可選的策略與蛋白靶點類似，比如，選擇具有復雜結構或者高質量結合口袋的 RNA motif；靶向 RNA-蛋白相互作用（branaplam、risdiplam）；調控 mRNA 可變剪切的 motif。

于文強認為，“RNA 存在兩個維度，一個是結構，一個是序列。不論是 RNA ****物還是蛋白質****物，其靶點要么是針對結構、要么是針對序列。”針對這種蛋白質結構設計的****物，有一些成功的案例。

“RNA 通過堿基互補配對，極容易受到環境的影響，導致結構極其不穩定，這也就意味著 RNA 的結構是高度動態的，是很難預測的。”于文強說道，“RNA ****物應該是以 RNA 序列靶向為主的發展。”

“RNA ****物目前很少，原因在于 RNA ****物進入體內會觸發免疫反應，雖然在實驗室的細胞環境中效果較好，但是一旦進入臨床試驗便會出現免疫反應和毒副作用等。”他補充說。但隨著mRNA疫苗的應用，其毒副作用問題將不再是一個瓶頸問題。

（來源：Pixabay）

但從這項研究發現到真正能夠實現將 RNA 作為靶點開發****物，還有很長的路要走。

在李陽看來，具體還需要克服兩大難題：其一，尋找特異性的 RNA 靶點；其二，擴展靶向 RNA 特異性結構的小分子庫。“這項研究的命中率極低，我們需要更多知識來定義哪些小分子更可能靶向 RNA，目前我們知之甚少，但高通量測序/實驗+AI 是很有潛力的解決方案。”李陽說道。

“我了解到的，其實 RNA 靶向的小分子****物開發已經興起快 20 年了，最近 10 年非常熱門。想要將 RNA 作為靶點開發****物，也需要重點解決脫靶效應。因為 RNA 和 RNA 之間非常類似，而小分子所能覆蓋的長度又不夠，所以很容易出現脫靶問題。”史家海指出。