湖南大學科學家研發新型DNA納米機器，攻克靶標分子無法檢測等難題，對細胞內低豐度miRNA實現精準靈敏的原位檢測

“惟楚有才，于斯為盛。”

湖南永州籍 80 后科學家黃晉，他的履歷從本科開始，就和湖南大學深深綁定。

本科和直博，均就讀于該校化學化工學院，博士則由美國佛羅里達大學和湖南大學聯合培養，博士后兩年在國家留學基金委資助下，留學美國并獲得博士學位。

值得注意的是，做博后研究時，他再次回到湖南大學。從當初化學化工學院的本科生，再到如今成為該學院的教授，20 年時光似乎“眨眼間”流過。

而他也成為了湖南大學岳麓學者、湖南省杰出青年基金獲得者以及教育部青年長江學者。

2021 年 12 月 22 日，黃晉團隊在 Nucleic Acids Research 上發表了一篇研究論文，題為《光控放大的FRET納米耀斑：時空可控的、mRNA 驅動的納米機器用于活細胞內微小RNA的精準、靈敏成像》（Photocaged amplified FRET nanoflares: spatiotemporal controllable of mRNA-powered nanomachines for precise and sensitive microRNA imaging in live cells）[1]，論文第一作者為李靜博士，黃晉擔任通訊作者。

該論文報道了一種時空可控的、細胞內源分子驅動的 DNA 納米機器，解決了活細胞內低豐度靶標分子“測不到、測不準”難題，實現了精準、靈敏原位檢測細胞內低豐度 miRNA 的目標。

據悉，miRNA 在細胞增殖、分化和凋亡過程中扮演著非常重要的角色，具有類似于致癌基因和抑癌基因的作用。

目前越來越多的數據表明：miRNA 的異常表達與人類疾病密切相關，被認為是診斷和預后的潛在生物標志物。

因此，對于更好地理解其功能、以及疾病相關的調節機理上，可視化定量細胞內 miRNA 具有至關重要的意義。

然而，目前細胞內低豐度 miRNA 原位檢測仍然面臨一些難題：

其一，miRNA 的部分內在屬性欠佳，例如小尺寸、高同源性、低豐度、易降解等；

其二，由于復雜的細胞內環境，生物分子自發熒光探針易被非靶標分子降解或者提早激活，導致檢測精準度低比如會出現假陽性；

其三，由于細胞空間尺寸的局限性，細胞內某些 miRNA 的豐度比較低，基于傳統的“一對一”信號觸發模式即一個靶標觸發一個信號，會導致檢測靈敏度不足比如會出現假陰性。

針對活細胞內原位檢測低豐度 miRNA 的精準度和靈敏度低的難題，黃晉團隊開發出上述時空可控的、內源性分子驅動的 DNA 納米機器，實現了細胞內低豐度 miRNA 的精準、靈敏熒光成像。

一方面，他們通過熒光共振能量轉移技術（FRET，fluorescence resonance energy transfer）比率型信號輸出，有效地避免了系統波動和化學干擾（例如：細胞內谷胱甘肽和 DNA 水解酶）帶來的假陽性信號。

同時，讓光照作為外界刺激物實時控制探針的初始活性，避免探針在內吞或者運輸過程中，即在到達腫瘤位點之前，被提早激活，產生高的非特異性信號，借此提高了檢測精準度。

另一方面，其巧妙地利用了內源性、高豐度的 mRNA 分子作為驅動力，實現了“一對多”信號觸發模式，即一個靶標觸發多個信號，最終實現了活細胞內低豐度 miRNA 的精準、靈敏成像。

冰凍三尺，非一日之寒，此次成果也得益于黃晉多年的積累。

2015 年，該團隊曾提出一種新型納米探針設計概念“FRET納米耀斑（FRET Nanoflare）”，相比傳統的單熒光染料標記的納米探針，該探針能有效地避免系統波動和化學干擾產生的假陽性信號，提高了檢測的精準度[2]。

但是，該 FRET 納米耀斑的設計仍然是基于“一對一”信號觸發模式，即一個靶標只能觸發一個信號，對于細胞內低豐度 miRNA 的檢測會面臨檢測靈敏度不足的問題。

因此，設計”一對多“信號觸發模式，即一個靶標觸發多個信號，是黃晉接下來要極力實現的目標。

脫氧核糖核酸酶（DNAzyme），是具有催化功能的單鏈寡核苷酸，它在特定金屬離子的輔助下能循環不斷地切割熒光標記的基底鏈，產生”一對多“信號放大模式，因此被認為是一種有效的信號放大策略。

2016-2017 年，黃晉和團隊設計了不同類型的基于 DNAzyme 的納米機器，其中包括適體酶（Aptazyme）、自切割核酶和裂開核酶，實現了細胞內低豐度分子的靈敏檢測[3-5]。

2018 年，基于催化發夾組裝（CHA）技術，他們又構建出一種發夾驅動的 DNA 納米機器，實現了活細胞內 miRNA 的放大成像[6]。

但是，上述設計通常需要外加輔離子、或輔助分子來驅動納米機器的循環運行，這不僅會導致檢測過程復雜化，而且會改變原有的檢測體系，進而會降低納米機器的運行效率。

此后，該團隊嘗試利用細胞內源性高豐度 mRNA 作為燃料分子驅動納米機器的運行。通過大量的文獻調研和多次細致的討論，他們巧妙構建了基于內源性、高表達的 mRNA 分子作為驅動力設計的一種放大的 FRET 納米耀斑。

本質上，FRET 納米耀斑是一種內源性 mRNA 驅動的 DNA 納米機器，最終可實現”一對多“信號放大模式，其檢測靈敏度相比于”一對一“信號觸發模式提高了大約 3 個數量級[7]。

然而，該探針的初始活性是不可控的，探針在到達腫瘤位點之前，一旦遇到靶標就會直接和它們相互作用，使探針被提早激活，產生非特異性信號，導致檢測精準度低。

由于光可以在空間和時間上被精準地操控，因此通常被作為一種有效地外界刺激物用于生物正交調節和精準調控生物傳感器的活性。

基于此，黃晉采用光照作為外界刺激物實時控制探針的初始活性，使探針在運輸或者內吞過程中一直處于失活的狀態。

進入細胞以后，通過光照在特定時間和特定地點被選擇性地激活。隨后，在低豐度 miRNA 的觸發下、以及高豐度 mRNA 的驅動下，探針即可自動地、程序性地在活細胞內運行，不需要外加輔助物。

這不僅有效簡化了操作過程，還可提高納米機器的運行效率，進而提高了檢測精準度和靈敏度。

探針進入腫瘤細胞以后，黃晉通過光照選擇地激活探針，隨后繼續與細胞進行孵育。

他和團隊發現，只有在光照和靶標分子同時存在的條件下，腫瘤細胞內才能產生很強的 FRET 熒光信號。在沒有光照的情況下，即使有 miRNA 的存在，細胞內也幾乎沒有明顯的 FRET 信號。

這說明該探針的初始活性是可控激活的，這種現象類似于“兩把鑰匙開一把鎖”，提高了檢測的準確度和可信度。

除此之外，為驗證其信號放大效果，該團隊采用傳統的“一對一”信號觸發模式的納米耀斑作為對照，發現其FRET熒光信號明顯低于本次實驗設計的“一對多”信號觸發模式的納米耀斑，表明“一對多”信號放大模式的檢測靈敏度顯著提高。

類似地，他們將時空可控的、mRNA 驅動的納米機器用于動物實驗，發現只有在光照和腫瘤組織同時存在的情況下，才能在腫瘤部位產生顯著的 FRET 熒光信號。

因此，遠程光激活的、放大的 FRET 納米耀斑能夠實現腫瘤組織內 miRNA 的精準、靈敏成像。

概括來說，此次研究理念為活細胞內原位熒光成像低豐度靶標提供了新的研究思路，避免了外加輔助物導致原有檢測體系破壞。

由于細胞內含有大量的蛋白、核酸和小分子，這為他們設計內源性分子驅動的 DNA 納米機器用于執行活體內特定的任務提供了前提條件。

黃晉說，研究中最讓人難忘的事，當屬該團隊每周的組會討論。在討論過程中，總會有新的問題不斷地被提出、隨后通過各種途徑不斷地尋求解決辦法。

問題解決時，那種“柳暗花明、茅塞頓開“的喜悅之情，以及在項目執行過程中大家孜孜不倦的探索精神，都變成了最美好、難忘的時光。

雖然內源性驅動的概念早有報道，例如小分子 ATP，但是 ATP 與其核酸適配體（aptamer）的相互作用力有限。

如何發展新的內源性驅動力設計“一對多”信號放大模式，是過去一段時間來團隊內部經常討論的話題。

在實驗以及投稿過程中，他們經歷了一次次失敗，一次次重復，沮喪過也迷茫過。

該團隊表示：“依然記得在文章來意見后補實驗的過程中，經常因為要做共聚焦實驗和電泳實驗熬夜到很晚，一天實驗之后，大家還要一起繼續討論實驗結果并制定第二天的實驗方案，每個人都樂此不疲。”

對于未來黃晉表示，精準、靈敏可視化定量細胞內低豐度分子，對于基礎研究和臨床醫學，都具有重要研究價值和應用潛力。

因此在后續研究計劃中，一方面可以結合腫瘤治療****物，實現診療一體化設計。另一方面，目前可利用的內源性驅動分子的種類和含量具有一定的局限性，在一定程度上限制了其廣泛的應用。

因此，有必要探究新的可利用的內源性物質，例如：內源性離子、小分子和蛋白質等，從而構建出內源性驅動的 DNA 納米機器執行各種新的任務。

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參考: 
1. Photocaged amplified FRET nanoflares: spatiotemporal controllable of mRNA-powered nanomachines for precise and sensitive microRNA imaging in live cells. Nucleic Acids Res.
2. FRET Nanoflares for Intracellular mRNA Detection: Avoiding False Positive Signals and Minimizing Effects of System Fluctuations. J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 8340-8343.
3. Aptazyme?Gold Nanoparticle Sensor for Amplified Molecular Probing in Living Cells.Anal. Chem. 2016, 88, 5981-5987.
4. Gold Nanoparticle Based Hairpin-Locked-DNAzyme Probe for Amplified miRNA Imaging in Living Cells. Anal. Chem. 2017, 89, 5850?5856. 
5. Gold Nanoparticle Loaded Split-DNAzyme Probe for Amplified miRNA Detection in Living Cells. Anal. Chem. 2017, 89, 8377?8383
6. Hairpin-fuelled catalytic nanobeacons for amplified microRNA imaging in live cells.Chem. Commun., 2018, 54, 10336-10339.
7. Amplified FRET Nanoflares: An Endogenous mRNA-Powered Nanomachine for Intracellular MicroRNA Imaging. Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 20104 -20111