90后科研伉儷發現ASA6新抗體，可減少動脈硬化斑塊形成，有望用于動脈粥樣硬化靶向診斷和治療

在青島大學讀碩士期間，張立煒完成了研究的主要部分，當時王語是張立煒隔壁課題組的師姐，也因為合作這次研究相識相知。目前，兩人已經領證成家，且也都在德國讀博。
9 月 28 日，相關論文以《用于動脈粥樣硬化的 MR/NIR-II 成像和抗動脈粥樣硬化治療的動脈粥樣硬化斑塊靶向單鏈抗體》（An atherosclerotic plaque-targeted single-chain antibody for MR/NIR-II imaging of atherosclerosis and anti-atherosclerosis therapy）為題發表在 Journal of Nanobiotechnology 上，張立煒擔任第一作者，王語是第六作者，在薛升教授的指導下，張立煒等人順利完成了這一研究。


今年 7 月，《中國心血管健康與疾病報告 2020》發布，報告顯示中國心血管病患病率處于持續上升態勢，患病人數約 3.3 億，其中冠心患者約 1139 萬。冠心病本屬于 “老年病”，但發病年齡也在逐漸降低。更令人擔心的是，報告顯示“心血管病致死”居中國城鄉居民總死亡原因首位。這說明，年輕人對 “心” 要 “上心”。


而張立煒發現的 ASA6，能和氧化的低密度脂蛋白以及動脈粥樣硬化斑塊結合，并能抑制巨噬細胞對低密度脂蛋白的攝取，從而減少巨噬細胞的凋亡。

在臨床工作中，張立煒發現缺血性心肌病并不完全由于冠脈血管性病變導致，常常會有其他原因導致與冠心病相似的臨床癥狀。同時，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病也存在個體差異性，但絕大部分缺血性心肌病患者均需進行冠脈造影術。

雖然冠脈造影術屬于微創手術，但從臨床角度觀察，患者由于各種原因也對此手術存在抵觸心理，同時也需要承擔價格不菲的造影費用。因此，從臨床角度出發，如何尋找一個患者接受度高價格又相對實惠的診斷方法，成為他想進行此項研究開發的初衷。


一般來講，缺血性心肌病患者需要首先進行血脂血糖心臟 B 超等常規檢查，進而輔助臨床醫生來判斷是否對患者進行冠脈造影術。但通過常規的臨床檢查，臨床醫生依靠經驗很難確切地了解冠狀動脈血管內的堵塞程度，因此一部分患者在做完冠脈造影術后發現并不是血管源性缺血性心肌病。

另外，通常情況下，患者先是接受冠脈造影術，此后根據個人情況進行冠狀動脈支架置入術（PCI 術），但也存在一些相對特殊的情況，如患者冠狀動脈粥樣硬化鈣化情況過于嚴重，并不適于進行 PCI 術。這些情況依靠臨床經驗很大程度上無法有效避免。

另外值得注意的是，動脈粥樣硬化實際上是一種全身性的疾病，只是冠狀動脈位于心臟這一關鍵位置，所以冠心病患者的臨床癥狀較為明顯。同樣，動脈粥樣硬化也是腦卒中的病理生理學基礎之一。

總結這些因素，是否能夠開發一個能一次性診斷全身動脈粥樣硬化、易于實現、并且患者接受度高的方法呢？同時，是否可以開發一種即可用于臨床診斷、又可用于臨床治療的方法呢？帶著這些初衷，張立煒開發了全新的基于抗體靶向的診斷和治療方案。

張立煒介紹，該項技術首先從病理生理學上驗證了對于自身脂代謝異常，人體自身免疫系統仍然可以產生有效的抗體，但這部分抗體的自身產生量無法有效抑制疾病的發生發展。

不過，這部分抗體的編碼序列被保存在淋巴細胞的基因序列當中。因此，可以利用這些被保存的基因序列在體外進行抗體重組、大規模生產和效果驗證等一系列操作。同時，該項研究也是 2018 年諾貝爾化學獎——噬菌體展示技術的最新應用。

有趣的是，張立煒發現他篩選出的抗體，可以誘導動脈粥樣硬化血管中的細胞產生 “線粒體阻滯” 效應，這是該研究最有趣且意外的發現。目前尚不清楚該效應確切的觸發機制、以及該效應所產生的血管保護作用的確切機制。但這為未來的研究提供了很好的方向和理論基礎。

研究中，張立煒先從臨床中獲得 55 例通過冠脈造影術明確診斷為血管動脈粥樣硬化患者的外周血，并從中分離了淋巴細胞。此后對這些淋巴細胞進行逐個的 Total RNA 提取并此過程中評估了 RNA 質量，進而對反轉并池化，最終獲得 55 例患者淋巴細胞 cDNA 文庫。

值得注意的是，人體產生的抗體在基因編碼層面存在保守序列，類似不同抗體序列均存在 “這是抗體序列” 的標簽。因此，在下一步中張立煒利用這些標簽作為 PCR 體外擴增的引物，將 cDNA 文庫中抗體編碼序列全部一次性擴增出來。最后通過 SOE-PCR 將編碼抗體長鏈和短鏈的基因序列拼接起來，形成人源抗體基因序列文庫。

接下來他將該抗體文庫插入質粒當中并導入大腸桿菌中，使得所有大腸桿菌成為下一步噬菌體展示的“食物工廠”。然后使用 M13 型噬菌體對這些大腸桿菌文庫進行侵染。

噬菌體進入大腸桿菌后，對利用大腸桿菌體內的營養物質重組產生新的噬菌體，但此過程中噬菌體會把他導入的抗體序列庫翻譯，并表達在噬菌體的蛋白 “帽子” 上。

接下來，他從臨床上收集了若干動脈粥樣硬化的人體血管樣本，并利用這些新產生的噬菌體對其進行了噬菌體展示篩選，最終淘選出大約 106 個陽性噬菌體，這其中每個噬菌體均存在一種特異性靶向動脈粥樣硬化板塊的陽性抗體。隨后，張立煒從中挑選了一種親和力最高的抗體并命名為 ASA6。

緊接著，他將含有 ASA6 的噬菌體再次導入相應的大腸桿菌，提取質粒并導入另外一種大腸桿菌，使其成為抗體大規模組裝的體外 “工廠”。

最終經過悉心繁殖和培養，張立煒從中提取并獲得了足量的 ASA6 抗體。并在體外通過蛋白印跡和免疫熒光等方法，進一步驗證了 ASA6 對動脈粥樣硬化斑塊和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的高親和力和特異性。

據他介紹，在蘇州大學放射醫學與輻射防護國家重點實驗室李楨教授的幫助下，他和團隊合成了含有金屬釓和金屬釹的納米顆粒，通過 EDC-NHS 反應將納米顆粒與抗體進行了偶聯，并通過透射電子顯微鏡和動態光散射儀等方法對偶聯物進行了物質形態的表征。

同時，他也對該偶聯物進行了生物相容度實驗，結果顯示該偶聯物并不會損傷實驗鼠的各個器官，偶聯物通過尿液有效排出體外。

此后，在核磁共振（NMR）和近紅外光（NIR）上，張立煒使用該偶聯物對高脂飲食的 ApoE 基因敲除鼠進行了靶向斑塊的顯影。結果發現在兩種不同模態下，該偶聯物均可對動脈粥樣硬化斑塊具有有效的示蹤效果。

同時，他將 ASA6 注射到高脂飲食的 ApoE 基因敲除鼠中，觀察其對動脈粥樣硬化的抑制效果，結果顯示 ASA6 可大大抑制動脈粥樣硬化斑塊的產生。他也對這部分小鼠血管進行了轉錄組分析，并明確了 ASA6 可誘導血管細胞產生 “線粒體阻滯” 效應，進而抑制了動脈粥樣硬化斑塊的發生發展。總之，這些數據證明了 ASA6 抗體在和無創成像中的潛力。

談及相關應用，張立煒表示，ASA6 抗體是一種人源性抗體。以往的抗體篩選，一般使用小鼠作為抗體篩選對象，但其篩選出的抗體為鼠源性抗體，對鼠源性抗體進行人源化處理，是一個繁雜且耗時耗力的工程。

而該研究直接獲取人源性抗體，避免了后期人源化的麻煩，因此可直接進行人體實驗。但仍面臨抗體組裝的問題。

其次，ASA6- 納米顆粒偶聯物有望實現一次性對全身所有血管動脈粥樣硬化斑塊的探測，高效且在大規模生產后大大降低臨床診斷費用以及獲得更為良好的患者接受度。

最后，本研究所發現的 “線粒體阻滯” 效應可為未來針對血脂代謝異常提供良好的病理生理學基礎和研究方向。未來對該效應進行細致研究后，有望開發出針對血脂代謝異常以及動脈粥樣硬化的高效治療****物。

提起研究中最難忘的事情，張立煒說由于他所在的研究所缺少一個探測設備，為此不得不驅車幾百公里前往蘇州大學國家重點實驗室進行實驗。其青島大學轉化實驗中心助理教授薛升為了他和小鼠的安全，親自開車載他前往蘇州。一路上，小鼠的味道彌漫整個汽車，最終他們安全抵達蘇州。因此，我十分感激薛升教授對我無微不至的關懷和幫助。

另外，由于冠心病患者具有凌晨發病的特點。因此當時收取患者外周血常常需要半夜前往醫院收集，并到實驗室進行下一步處理。張立煒說，雖然自己在本科期間已經獲得駕駛證，但一直不敢在真實路況開車。在收集樣本的那段時間，他也得以明顯提高駕駛技術和膽量。

張立煒今年 26 歲，出生于山東省青島市，目前博士就讀于德國慕尼黑大學，并在德國亥姆霍茲糖尿病研究中心從事心血管疾病與糖尿病的相關研究。該研究完成于在青島大學讀碩期間，在國內時他還曾跟隨青島大學附屬醫院周長勇教授從事臨床冠心病的診治工作。
對于未來張立煒表示，目前人工智能正在醫學行業興起。AlphaFold 2 的發布大大加快了蛋白質結構解析和抗體行業的發展。他認為使用大規模訓練集完美預測抗體結合抗原，將成為該領域的研究熱點。

相比新興 AI 計算，傳統生物實驗室實驗仍存在效率低效、資源消耗嚴重的問題。在這一問題上，他將和愛人將繼續結合人工智能技術開發出更高效的疾病相關抗體。
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