半年「吸金」超6億美元，火熱的環狀RNA如何激活新產業？基因治療和新****開發將是其最具價值的方向

2020 年，Moderna 和 BioNTech 開發的 mRNA 疫苗在不到一年的時間內相繼獲 FDA 批準有條件上市，這讓底層技術 mRNA 技術備受關注，并在全球范圍掀起一股創新技術熱潮。

2021 年 2 月，全球首家 “環狀 RNA” 初創 Orna Therapeutics 獲 8000 萬美元融資并正式走出隱匿模式，這也預示著 “mRNA2.0” 時代的來臨。理論上，與線性 RNA 相比，這種環狀 RNA——oRNA 呈封閉環狀的結構，不易降解，可更高效穩定地表達蛋白質。

與此同時，越來越多的 mRNA（自擴增 / 非復制）技術、環狀 RNA 等初創如雨后春筍般涌現，不斷推陳出新，斬獲大額融資。

2021 年 5 月，環狀 RNA 公司 Laronde 帶著 4000 萬美元正式出道，時隔 3 個月后，該公司再次斬獲 4.4 億美元融資。無獨有偶，Laronde 與 Moderna 同為 “資本的寵兒”，還師出同門，均由美國知名風險機構 Flagship Pioneering（以下簡稱 “FP”）孵化。

該公司把其正在研究的環狀 RNA 稱之為 Endless RNA?（eRNA），并宣稱 eRNA 具有持久性、非免疫原性、允許重復給****、靈活的配制和遞送方式等優勢。理論上，這種 RNA 能夠在體內長期存在，并表達用于治療疾病的蛋白質。

今年 6 月，國內環狀 RNA 公司環碼生物正式成立并斬獲千萬美元天使輪融資；國內環狀 RNA  產研服務商吉賽生物也在從服務轉向基于具有重大功能的環狀 RNA 翻譯產物開發疾病治療靶點。
與線性 mRNA 相比，環狀 RNA 的優勢是什么？整體研發現狀如何？真正釋放產業化潛力還有哪些難題有待解決？

1976 年，德國科學家 Heinzl. Sanger 等人在 PANS 發表文章，證實了類病毒（Viroids）是一種單鏈共價閉合環狀 RNA 分子，這是人類首次發現環狀 RNA 分子的存在。但在當時的背景下，科學家們只將其看作一種冗余的錯誤剪接產物。
2012 年，斯坦福大學的生物醫學和生物化學副教授 Julia Salzman 發現人體中大量存在一類環狀 RNA 暗物質，被譽為 "改寫教科書的重****現"。
2013 年，Nature 報道了兩篇文章，首次在功能上表征天然環狀 RNA 分子；2014 年，在擬南芥中也確認了 circRNA 的存在，由此拉開植物 circRNA 的研究序幕。自此，大量科學家開始涌入這個領域。
同一時期，在國外，美國 RNA 技術開發公司 Arraystar 推出全球首款商業化的環狀 RNA 芯片；在國內，中科院生物物理研究所的范祖森教授課題組研究了小鼠骨髓細胞中分離的長期造血干細胞和多能干細胞的環狀 RNA 的表達譜，曹雪濤院士課題組研究了環狀 RNA 在肝癌中發揮的功能。

大多數真核基因以內含子和外顯子間隔排列，轉錄本通常需要通過可變剪接去掉內含子，這種機制可以從特定的基因中產生多種 mRNA 分子。在人類基因組中，95 % 以上的基因是具有可變剪接的，它們通常由順式調節元件和反式作用因子共同調控。這其中，除了產生各種線性 mRNA 之外，許多真核基因也產生出具有末端共價連接的環狀 RNA。即下游剪接位點與上游剪接位點連接形成的閉合環狀分子。
其次，外顯子跳讀所形成的套索驅動環化也是環狀 RNA 生成的一種機制；此外，剪接過程中從分支結構脫離的內含子索套也會產生環狀 RNA。

長期以來，環狀 RNA 一直被認為是 mRNA 剪切過程中的副產物，沒有特定的功能。但近年來，人們在真菌、原生生物、植物、果蠅、小鼠以及人類細胞中相繼發現很多環狀 RNA。越來越多的研究表明，環狀 RNA 并非 mRNA 剪切的副產物，而是在細胞中發揮重要作用的一類 RNA 分子。
這種 RNA 相當于線性 RNA 分子中的 3’ 和 5’ 端被連接形成了閉合環狀結構，失去了 PolyA 尾巴，因此對核酸外切酶不敏感，也可以更加穩定地存在。
香港城市大學生物醫學系助理教授史家海表示，“環狀 RNA 的優勢主要在于可以防止降解，提高 RNA 的表達時間和表達量，因為 RNA 的降解是從尾端開始，環化后就沒有酶切的尾端了，只有 RNA 核酸內切酶才能切，所以環狀 RNA 比線性 RNA 在血漿中的表達時間更長，預計在細胞中也是更長。” 史家海在 3 年前就開始了環狀 RNA 的相關研究。
在 FP 推出環狀 RNA 公司 Laronde 之際，其首席執行官 Diego Miralles 就曾表示，除了可以在體內長效穩定表達之外，環狀 RNA ****物還可以重復給****，并且可以通過多種途徑向患者給****，包括皮下、靜脈、肌內和外用的方式。

與線性 mRNA 相比，環狀 RNA 是閉合的環狀結構，不能利用真核細胞的翻譯機制，需要依賴一些翻譯啟動元件的參與啟動翻譯。目前已經發現的環狀 RNA 的翻譯方式主要有核糖體介入位點 (internal ribosome entry site，IRES) 介導的翻譯、滾環擴增翻譯、由 UTR (untranslated region) 翻譯激活元件介導的翻譯和 m6 A 修飾介導的翻譯 。
"目前主流的是 IRES，因為這個元件能夠被核糖體識別，比較獨特，很多做環狀 RNA 的公司都會選擇這種方式"，吉賽生物的 CEO 劉明告訴生輝，" 滾環翻譯的方式能夠讓環狀 RNA 翻譯產生不同大小的蛋白質，也可以利用有限的核苷酸序列翻譯出更大的蛋白質，這是 mRNA 無法做到的事情，在產業化上更有想象空間。" 吉賽生物是在環狀 RNA 賽道蟄伏 7 年的產研服務商，正在布局產業化賽道。
上海環碼基因的聯合創始人王澤峰也在接受媒體采訪時表示，只要 mRNA 可以干的事情，環狀 RNA 都可以干，但是環狀 RNA 又能干一些 mRNA 干不了的事情。
Laronde 的首席執行官 Diego Miralles 就表示，其環狀 RNA 平臺能夠在體內表達任何治療性蛋白質，包括肽、凝血因子等，任何類型的治療性抗體，包括跨膜蛋白、疫苗等，甚至是生物學上從未做過的事情，例如細胞內抗體或離子通道。并且宣稱團隊已經證明其環狀 RNA 可以在動物體內獲得穩定、持久的蛋白質生產。

自 1976 年發現環狀 RNA 分子以來，學術界開啟了對環狀 RNA 的漫漫探索之旅。2013 年，學術界在環狀 RNA 領域取得重大進展，越來越多的科學家們進入了該領域。
基礎研究興起的同時，產業轉化的潛力也已初現。整體來看，產業化發展的方向又可以大體分為科研服務（測序分析、構建）、IVD、CXO、****物研發等幾類，其中****物研發也被視為極具潛力的細分領域。“個人認為，對標 mRNA，環狀 RNA 擁有無可比擬的優勢，基因治療和新****開發將是其最具價值的方向。” 劉明說。
國外基于環狀 RNA 的測序公司包括 Arraystar、IntegrateRNA、CD Microarray、 Cofactor Genomics 等，其中 Arraystar 公司曾推出全球首款商業化的環狀 RNA 芯片。
根據不完全資料統計，目前國內涉及環狀 RNA 相關方向的公司，90% 的公司以上融資規模較小，近 70% 的公司主要業務以科研服務為主，近 30% 的公司以環狀 RNA 為標志物來檢測疾病，布局 CXO 服務的有銳博生物、吉賽生物。
在****物研發領域，全球整體產業化進展較慢，其中美國環狀 RNA 進展最快，今年上半年走出兩家初創公司 Orna Therapeutics 和 Laronde，且融資金額屢創新高。這兩家環狀 RNA 公司均由知名 VC 孵化而來，含著 “金湯匙” 出生；國內在環狀 RNA ****物研發領域與美國相差不大，但環狀 RNA ****物研發公司整體披露的信息比較少，現已披露的公司有 2010 年成立的吉賽生物，2021 年成立的環碼生物，融資規模比較小。
公開資料顯示，半年內全球環狀 RNA 領域累計獲得超 6 億融資，美國兩家公司獨占 5.7 億美元，國內環碼生物斬獲千萬美元融資，吉賽生物暫未融資。

Orna Therapeutics 帶著 8000 萬美元亮相之際，背后站著知名 VC 和 BMS、Kite、諾華生物醫學研究所等制****大廠。該公司的創始團隊為 Alex Wesselhoeft 和 Dan Anderson 領銜的 MIT 團隊，他們在 2018 年、2019 年取得一系列進展，相關成果也發布在《自然》和《細胞》上。作為全球首家環狀 RNA ****物研發公司，該公司將其開發的環狀 RNA 稱之為 oRNA，他們認為 oRNA 相當于 mRNA2.0 版，在生產、遞送和治療效果方面更具有優勢。
3 個月后，Laronde 也正式亮相，他們將其開發的環狀 RNA 稱之為 “eRNA”，Laronde 的目標是在未來 10 年內生產 100 種基于 eRNA 的****物。
同年，國內環狀 RNA 初創公司環碼生物成立，并于今年 6 月完成了千萬美元天使輪融資。該公司由中科院營養與健康研究所教授、中科院計算生物學重點實驗室主任、RNA 系統生物學課題組組長王澤峰教授創辦。他在環狀 RNA 調控機制和工程化應用方面具備一定研究成果和技術積淀；中科院上海營養與健康研究所副研究員楊赟博士是環碼生物的共同創始人兼 CTO，他在 RNA 體外環化和環狀 RNA 翻譯效率調控等方面同樣具有多年基礎研究和技術開發經驗。
吉賽生物則是一家成立 11 年之久的環狀 RNA 產研服務公司，同時也是國內最早布局環狀 RNA 的公司。該公司最初以提供環狀 RNA 基因治療的 CRO 和 CDMO 服務起家，主要聚焦環狀 RNA 核心技術和完備的環狀 RNA 研究體系。今年 8 月，劉明在接受媒體采訪時透露除了環狀 RNA CRO 服務以外，吉賽生物還將基于前期發現具有重大功能的環狀 RNA 翻譯產物開發疾病治療靶點。
“總體來看，無論是線性 RNA 還是環狀 RNA 都才剛剛起步，上游技術和科研成果的儲備尤其重要。如果新冠疫情還未得到很好控制，而且環狀 RNA 疫苗比目前疫苗的免疫效果更好，環狀 RNA 可能會得到很好很快的應用。” 劉明說。

盡管環狀 RNA 優勢明顯，產業化潛力巨大，但也有諸多問題需要解決。
史家海告訴生輝，環狀 RNA 目前面臨的首要問題是環化效率低；其次，環狀 RNA 沒有 5‘端的帽子結構，所以需要內部核糖體進入位點作為啟動區域，但是內部核糖體進入位點的效率沒有帽子的效率高。史家海表示正在開發 RNA 復制酶以解決 RNA 連接缺口不平的問題。
在過去幾年間，環碼基因王澤峰實驗室也一直專注于環形 RNA 的翻譯效率上。此外，該實驗室也在深入研究 AI，以便通過序列設計來提高相關性能。
至于其在未來應用上是否會超越線性 RNA，史家海直言，“如果是需要提高表達量的應用，環狀 RNA 效果會更好。”
在產業轉化上，精準快速的環狀 RNA 制備仍然是技術難題。劉明告訴生輝，“目前環狀 RNA 制備的主流技術主要是體外轉錄后自剪切形成環狀 RNA。此方法制備的環化 RNA 也會參入無關序列，影響環狀 RNA 天然結構和獨特功能；另外使用連接酶進行 RNA 的環化連接，會產生相當多的聚合副產物，實際合成以及后續的產物純化回收過程較復雜，導致制備效率低，不利于產業化。另外，規模化量產也是產業化的難題之一。”
需要注意的是，今年 7 月，Cell Reports 在線發表了上海交通大學 Bio-X 研究院 PI 胥川博士和美國密西根大學張建之教授關于哺乳動物環狀 RNA 的研究。
該研究給出了一系列證據表明環狀 RNA 大部分源自于剪接錯誤，并估算出超過 97% 環狀 RNA 是無用甚至有害的，他們認為絕大多數環狀 RNA 是垃圾 RNA。但這與少數環狀 RNA 被證實具有功能的事實并不矛盾。
參考資料：

• http://news.sciencenet.cn/htmlpaper/2021/8/202182016253068065868.shtm

• https://www.researchgate.net/publication/332677132_The_emerging_roles_and_functions_of_circular_RNAs_and_their_generation

• https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)00856-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2211124721008561%3Fshowall%3Dtrue