突變率提高23萬倍、可一天完成變異篩選，新型定向進化系統或可用于哺乳動物細胞 | 專訪易嘯

在非哺乳動物細胞中進化得到的蛋白質，常常會因錯誤的折疊修飾、分子間相互作用、錯誤的細胞定位等因素，無法在復雜的哺乳動物細胞中正常工作。因此，開發能夠應用于哺乳動物細胞中的定向進化技術是一大趨勢。

“我們開發的 TADR 系統應用范圍更廣，在大腸桿菌、酵母甚至哺乳動物細胞中都有應用潛力。” 易嘯說。

易嘯是中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所（以下簡稱為 “合成所”）研究員，博士師從明尼蘇達大學分子進化學家 Antony Dean 教授學習種群遺傳學和生態學，并與其導師提出了生物多樣性的新理論，后期從理論轉向實驗研究。他在博士后期間與工程生物學結緣。

今年 7 月，易嘯作為第一作者和并列通訊作者在 Science Advances 上發表最新研究成果。該團隊利用合成生物學的方法開發了一個 “智能” 細菌系統 —— 靶向性人工 DNA 復制體（TADR），該系統能夠在活細胞內將大量突變快速靶向到指定的任意一段 DNA 序列上，而不會影響基因組的其他部分。

“TADR 系統將突變率提高了 23 萬倍，一天即可完成變異篩選，快速進化基因。我們正在探索潛在應用方向，比如說用該系統進化指定的大分子或者抗體。” 易嘯

TADR 系統是易嘯在博士后期間的一個合成生物學項目。在博士后研究階段，易嘯花費 5 年時間獨立設計開發出了 TADR 系統，并獲得了相關技術的美國專利。現在他已經在合成所材料合成生物學中心成立了合成進化實驗室，該實驗室的一大重點就是圍繞 TADR 系統展開基礎研究和探索應用場景，解決科學和生產問題。 

易嘯坦言，現階段，TADR 系統是其在研究生涯過程中最有成就感的一項研究。

將突變率提高 23 萬倍，一天即可完成變異篩選

細胞外突變法是目前最為成熟且直觀的一種定向進化方法，包括易錯 PCR（error-prone PCR）、易突變菌株（mutator strains of bacteria）以及可產生非隨機突變的定點突變（site-directed mutagenesis）等。

然而，這種方法往往需要密集的人工操作，多數情況下只能在有限的突變庫上進行一輪進化。如果想要得到更有優勢的蛋白質，或者完成更復雜的定向進化目標，就需要更大體量的突變庫，以及進行多輪迭代進化。

為了突破這些瓶頸，加快進化速度，更快獲得更復雜的進化目標，研究人員開始嘗試開發細胞內突變方式。

易嘯團隊開發的 TADR 系統就是一種細胞內突變方法，整個進化過程在活細胞里面完成。TADR 系統系統也叫最簡 DNA 復制體，是由三個蛋白質組成的蛋白復合體，分別為噬菌體蛋白 CisA、細菌 Rep 解旋酶、T5 噬菌體 DNA 聚合酶的出錯性突變子。

該系統能夠在短時間內把大量突變靶向指定的 DNA 上面，同時保留基因組其他部分的完整性。

具體來說，他找到了一種噬菌體，其在天然復制過程中有一個能夠特異性識別 30 堿基對序列的蛋白，識別以后，噬菌體就從該位點開始復制 DNA。所以他把出錯率高的 DNA 聚合酶融合到了這個噬菌體的蛋白上，利用這個噬菌體的蛋白去把出錯率高的 DNA 聚合體靶向到指定突變的 DNA 上游。

易錯 PCR 是一種簡便快速在 DNA 序列中隨機制造突變的方法，通過改變傳統 PCR 反應體系中的 Mg2+ 濃度、dNTP 的濃度比例、pH 值等，使堿基在一定程度上隨機引入錯誤而創造序列多樣性文庫。這種方法的關鍵在于控制合適的突變頻率，較低的突變率能夠積累大部分的有益突變，而較高的錯摻率則會產生中性突變或有害突變。

“與基于出錯 PCR 和體外質粒構建的傳統定向進化方法相比，TADR 可以避免分子連接、細胞轉化等效率極低的步驟，從而實現在活細胞內快速連續進化分子和細胞表型的潛力。” 易嘯說。

該團隊進一步對 TADR 系統進行了量化，研究表示，與野生型突變速率相比，TADR 的突變速率提高了約 23 萬倍，即 2.3*10^5。

易嘯表示，該系統可以快速找到非常低頻的有益突變，加速分子突變速率。比如說，使用傳統方法可能需要一個星期，利用 TADR 只需一天即可完成變異篩選。

該系統可能會與合成所大設施的功能結合起來，相當于添加了一個分子突變的功能檔。易嘯透露，還需要在功能檔上加一個細菌生長培養的模塊。最終與大設施形成一個連續突變和大規模篩選的閉環，不斷繼續循環，能夠非常快速在實驗室里面進化出我們想要的大分子。

操作簡單，應用場景更廣

在細胞內連續突變領域，目前已有兩大成熟系統，一是哈佛大學劉如謙團隊于 2011 年開發的噬菌體輔助的連續進化方法（phage-assisted continuous evolution，PACE），另一種方法是加州大學爾灣分校教授 Chang C. Liu 開發的一種正交 DNA 聚合酶 - 復制子系統（orthogonal DNA replication，OrthoRep）。

PACE 系統在許多蛋白質進化應用中已經得到了驗證，但是只有與細菌中基因轉錄相關時，PACE 系統才可以進化給定的目標蛋白。也就是說，給定的目標蛋白只能在大腸桿菌細胞質進化，折疊不良或者需要翻譯后修飾都會妨礙利用 PACE 系統的進化。 

與 PACE 系統類似，OrthoRep 系統對生物物種也有選擇性，需要與酵母增殖活動相關，只能在酵母（真核細胞）中才能進行功能性表達。

“這兩大系統在概念上實現了一定的創新，可以相應解決一些問題，但是存在一定的局限性，很多分子進化問題無法利用這兩個系統解決，應用場景受限。” 易嘯說。

正是看到了這兩大系統各自存在的盲區，易嘯在博士后研究期間專注于開發一種可以在哺乳動物甚至更多生物物種中使用的系統。

在論文中，易嘯利用合成生物學思路構建了 TADR 系統，該系統結構簡單，可以實現模塊化，比如說關閉 TADR 系統后，細胞和目標質粒仍然能夠繼續增殖。模塊化能力也提供了 TADR 擴展到其他細胞類型甚至無細胞系統中的可能性。 

易嘯介紹，TADR 系統比前兩個系統操作更加簡單，更容易上手。從原理上講，它可能在酵母、甚至哺乳動物細胞中快速進化，應用場景很廣，幾乎沒有限制。 

“我的實驗室接下來將會開展相關研究，把該系統應用到不同的物種中，進一步擴大應用范圍。” 易嘯繼續補充。

現階段，易嘯將該系統的應用方向瞄準了材料領域，現已與合成所材料合成生物學中心研究員鐘超進行了深入交流。

“材料研究涉及到物理、化學原理和實驗，而這些也恰恰是做進化、篩選的基礎。實現物理、化學、生物的交叉融合，這是一個比較新的應用方向，我們可以在實驗室快速進化和篩選活體材料所需的性質，加強現有材料性質，甚至進化出一些原本不存在的材料性質。”

“合成所的學術氛圍就像年輕人共同創業”

今年是易嘯回到合成所成立實驗室開展研究工作的第一個年頭，他于 2008 年本科畢業后赴美攻讀博士學位，加入合成所之前，他已經在海外求學 12 載。

對于易嘯來說，TADR 系統的設計和開發工作也并非一帆風順。

“在美國進行博士后期間，我用了整整 5 年才開發出 TADR 系統。其中前 3 年半全部都在試錯，而且失敗得一塌糊涂，TADR 系統最開始的設計和現在的設計幾乎完全不同，所以開發出的系統一直存在缺點。直到最后一年半時間，TADR 才開始達到預期，可想而知，我在前 3 年半時間面臨的一些困難和內心的煎熬。” 易嘯回憶道。

在他看來，科研工作中總是會經歷或大或小的挫折，我認為在這期間最重要的是要對科研工作保持堅持執著的心態。

“作為一線科研人員，我們需要做一些科學探索工作，不斷探索人類未知的前沿領域，發現新概念，甚至顛覆一些陳舊的認知。同時還需要有一定的社會關懷，制定與社會利益相關的遠大目標。” 易嘯說。

這一點也與中國科學院深圳先進技術研究院（以下簡稱深圳先進院）“頂天立地” 的理念也不謀而合。即 “天” 是學問，“地” 是產業，“頂天立地” 理念貫穿于深圳先進院十個所的發展始終，作為其中較為年輕且發展迅猛的研究所，合成所亦是如此。換言之，造物致知就是頂天，造物致用就是立地。

“ 合成所的學術氛圍很活躍，老師們也都很年輕，加入合成所就好像一幫年輕人共同去創業，大家一起去干一番自己的事業。” 易嘯坦言。

關于未來的發展規劃，易嘯將重點圍繞兩個研究方向：第一個方向是偏向于基礎科學研究，在實驗室進化細胞，將統一進化過程重復 N 次，探索生命體的可能空間；第二個方向是基于 TADR 的工程應用，在三年內使該技術更成熟，未來可以讓蛋白質工程、大分子開發人員等更多科研人員都可以用上 TADR 系統。

同時，觀鳥是易嘯的愛好之一，辦公桌上的望遠鏡、單反相機都是他觀鳥的必備神器。最近易嘯老師會在深圳先進院旁邊的大沙河公園中用無人機拍水鳥，“以鷺這種類型的鳥為例，在大沙河上基本都能夠找到，比如蒼鷺、大白鷺、小白鷺，夜鷺……”