參比型SPR生物芯片的檢測

　　1 引言

　　SPR生物傳感器是上個世紀末期發展起來的新型光學生物傳感器，它可以無標記地檢測待測物與芯片上固定分子間的結合反應。SPR生物傳感器可以實時監測芯片表面發生的各種結合、解析反應，已經成為一種成熟的檢測生物分子間相互作用的方法。

　　靈敏度高是SPR生物傳感器的特點之一，它甚至能測量到由于溫度變化而引起的信號變化。同樣溫度、溶液濃度等非反應因素的變化也會引起SPR信號的變化。這樣的過度靈敏性，或者可稱為過敏性，有時候甚至會影響我們對于反應信號的判斷。為了消除這種過敏性就需要進行信號補償，而信號補償試驗的進行又很難保證完全重復發生反應時的各種條件，參比型SPR生物芯片的出現解決了這一問題。通過參比信號與檢測信號的比較，可以很容易地知道SPR反應曲線的變化是由于生物反應的進行還是由于外界因素的變化而引起的。

　　2 儀器與芯片

　　實驗中采用的是崔大付課題小組自行研制的單通道雙參數參比型SPR生物傳感器(圖1，國內專利申請號200510053510.6)。

　　參比型SPR生物芯片(圖2)是自行制備的一種在金基底上進行了葡聚糖修飾的生物芯片。該芯片分為兩個測量位點，兩個位點采用不同的修飾方法，其中一個作為檢測位點，可以與蛋白類物質發生結合反應從而將配基牢固固定在芯片表面。參比位點也有一層葡聚糖膜，但由于沒有進行羧甲基修飾，不會與配基發生結合反應。參比位點可以發生等離子體諧振，將流通池內溶液的溫度、流速、本體溶液折射率、非特異性吸附等因素都在參比曲線上反映出來。

　　3 實驗方法

　　首先在芯片背面滴一滴香柏油，然后將芯片小心地貼在傳感器的棱鏡表面，注意在芯片與棱鏡間不要有氣泡，然后將流通池對準光斑安裝好并擰緊。

　　芯片安裝好后，首先向流通池內通入HBS緩沖液。角度掃描后在吸收峰的左側直線部分選擇一點進行定點監測。定點監測開始后先進行HBS清洗，待檢測與參比曲線的基線穩定后，將等體積新鮮混合的EDC和NHS溶液通人流通池內活化SPR生物芯片表面的羧基。20 min后HBS清洗，然后通入pH值為4.6，0.5 mg/ml的人IgG溶液至固定信號基本穩定。HBS清洗后再通入乙醇胺滅活芯片表面的活性位點。20 min后HBS清洗，然后通入HBS稀釋5倍的效價為1：10的羊抗人IgG溶液，信號基本穩定后HBS清洗。

　　4 結果與討論

　　試驗結果如圖3所示，圖中曲線分別為檢測曲線和參比曲線。活化和滅活時檢測曲線與參比曲線信號均隨著本體溶液的變化而變化。通入人IgG溶液后檢測曲線上的固定信號上升明顯，而參比曲線基本不變;通入羊抗人IgG溶液后檢測信號繼續上升，而參比信號仍然不變。

　　試驗中檢測曲線與參比曲線在活化與滅活時信號變化趨勢一致，在通入人IgG和羊抗人IgG溶液時兩者差異明顯，說明了：(1)參比位點沒有固定蛋白，參比區檢測到的信號為溶液本體折射率發生變化引起的變化，沒有蛋白的固定與結合反應，具有良好的參比性;(2)檢測位點在活化后可以固定人lgG;(3)羊抗人IgG可以與固定在芯片上的人IgG發生免疫結合反應。

　　5 結 論

　　羊抗人IgG是人IgG的抗體，該試驗是一個固定抗原檢測抗體的模型。試驗的成功表明參比型SPR生物芯片的檢測位點可以固定抗原，固定的抗原可以與溶液中的抗體發生免疫結合反應。參比位點可以發生等離子諧振，但沒有化學活性，不會與反應過程中的蛋白發生反應，具有良好的參比性。