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        理想的三聚氰胺檢測方法

        作者: 時間:2012-11-13 來源:網絡 收藏


        樣品制備

        三個不同的牛奶樣品——天然的全脂牛奶、脫脂牛奶以及天然奶粉制成的人造奶——加入純的三聚氰胺。這三種不同的乳制品與三聚氰胺儲備液(濃度為2mg/mL的蒸餾水溶液)混合制成加標樣品。三種牛奶均加入20及100礸/L的三聚氰胺,全脂和脫脂牛奶樣品另外再加入濃度為550及1,000礸/L的三聚氰胺。

        對于第一種檢測試劑盒,加標牛奶樣品按試劑盒操作方法進行制備:

        ◆在潔凈試管中加入大約1mL加標牛奶樣品;
        ◆樣品在1,500 g、10 ℃下離心10分鐘;
        ◆取脂肪層下部分200礚轉入潔凈試管中;并且牛奶乳清中加入800礚檢測稀釋液,仔細混合稀釋樣品。

        對于第二種試劑盒,根據生產商直接提供的信息,對樣品的制備方法稍加調整,以提高檢測靈敏度。如果根據原有的說明制備牛奶樣品,會發現靈敏度低于第一種方法,因為根據原有的說明檢測樣品被稀釋過量:

        ◆潔凈試管中加入大約1mL加標牛奶;
        ◆樣品在1,500g、10 ℃下離心10分鐘,分成3層;
        ◆取中層250礚,轉入潔凈試管中;并且
        ◆取出液體以1:3的比例加入10%的甲醇/PBS溶液(20mM)。

        “經典的(酶聯免疫吸附測定)測量可以作為一個理想的解決方案。這種方法可以在微孔板中進行,因此樣品數量較多時可以同時進行,儀器成本也不高。”

        兩種試劑盒的使用都參照生產商的說明。抗體包被的微孔中加入三聚氰胺標準品或加標樣的加入量為100或150礚(取決于試劑盒)。隨后每一個微孔中加入50礚 HRP——三聚氰胺標記物,混勻微孔板并在室溫孵育30分鐘。蒸餾水沖洗去除未結合的樣品。300 礚蒸餾水重復沖洗4次。100礚 HRP——底物分裝入每一個微孔中,微孔板在室溫下再次孵育20或30分鐘(取決于試劑盒)。加入100礚終止液終止反應,使用六種不同的酶標儀在450nm測定吸收值。制作校準曲線,用于確定未知濃度。(該曲線可以根據吸收值或是準確值進行計算,空白對照的吸收值被設定為100%。)

        校準曲線及檢驗靈敏度

        利用第一種試劑盒制作的三聚氰胺校準曲線,使用了六種不同型號的酶標儀進行測定。計算第二種試劑盒的校準曲線時,只使用了兩種酶標儀。以前的數據顯示檢測儀對結果沒有影響。該方法的檢測限(LOD),是使用標準IUPAC 3*SD方法,根據校準數據以及空白對照樣品的數據進行計算。

        這些方法所需的測量范圍,與所有酶標儀具有良好準確度的波長范圍一致。這些方法的檢測限在很大程度上取決于測光讀數儀的準確度和精確度。因此,LOD值之間僅存在極小的不具備顯著性的差異。對于兩種試劑盒,低于10 礸/L的三聚氰胺濃度能夠輕易檢出。因此,方法檢測三聚氰胺的準確度與LC/MS/MS相當。

        三聚氰胺的測定

        三種不同的牛奶加入純的三聚氰胺,用兩種試劑盒進行分析。采用一系列不同的光度計進行測量。

        數據表明,兩種試劑盒測定的酶活非常接近,回收率差異小于10%。此外,兩種試劑盒都存在一個相同的趨勢,即三聚氰胺高濃度樣品的濃度測量值稍偏低;不過,這對這些方法的使用不會產生影響,因為所有樣品還會作為篩選檢測的高濃度陽性樣品進行測定。因此,結果明確表明,ELISA檢測適合用于篩選,包括未知牛奶樣品中三聚氰胺的檢測。

        根據前述結果,兩種測試都能用于準確測定乳制品中三聚氰胺的殘留量。測試的靈敏度與質譜分析的靈敏度相當。不過,與相比,ELISAs具有成本方面的優勢。這種簡便、高通量的篩選方法能夠以較低的儀器成本、適中的運行價格,對上千個樣品進行大規模的篩選。

        雖然這些方法對牛奶樣品中高濃度三聚氰胺的測定值稍低,但是其靈敏度達到的水平依然適合對三聚氰胺進行篩選,作出有/無的判斷。當這些方法用于篩選時,陽性樣品隨后仍然需要使用LC/MS/MS 或 GC/MS/MS方法確定三聚氰胺的確切含量。

        這種快速(總的檢測時間:大約1小時)并且具備成本效益的方法可以檢測牛奶中三聚氰胺的殘留量,從而對乳制品進行高效的篩選,這確保了任何污染物都能被快速、簡便地發現。

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