離心技術的應用

　　由于ρ_P＞ρ_m可知S＞0，因此該離心法的離心時間要嚴格控制，既有足夠的時間使各種粒子在介質梯度中形成區帶，又要控制在任一粒子達到沉淀前。如果離心時間過長，所有的樣品可全部到達離心管底部；離心時間不足，樣品還沒有分離。由于此法是一種不完全的沉降，沉降受物質本身大小的影響較大，一般是應用在物質大小相異而密度相同的情況。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。

　　（三）等密度離心法

　　等密度離心法是在離心前預先配制介質的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，當梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時原來分布均勻的粒子也發生重新分布。當管底介質的密度大于粒子的密度，即ρ_m＞ρ_P時粒子上浮；在彎頂處ρ_P＞ρ_m時，則粒子沉降，最后粒子進入到一個它本身的密度位置即ρ_P＝ρ_m，此時dx/dt為零粒子不再移動，粒子形成純組份的區帶，與樣品粒子的密度有關，而與粒子的大小和其他參數無關，因此只要轉速、溫度不變，則延長離心時間也不能改變這些粒子的成帶位置。

　　此法一般應用于物質的大小相近，而密度差異較大時。常用的梯度液是CsCl。

　　（四）梯度溶液的制備

　　⒈梯度材料的選擇原則作為一種理想的梯度材料應具備以下幾點：①與被分離的生物材料不發生反應即完全惰性，且易與所分離的生物粒子分開。②可達到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內，粘度低，滲透壓低，離子強度和pH變化較小。③不會對離心設備發生腐蝕作用。④容易純化，價格便宜或容易回收。⑤濃度便于測定，如具有折光率。⑥對于超速離心分析工作來說，它的物理性質、熱力學性質應該是已知的。這些條件是理想條件，完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒有的。下面介紹幾種基本上符合上述原則的梯度材料：①糖類：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。②無機鹽類：CsCl（氯化銫）、RbCl（氯化銣）、NaCl、KBr等。③有機碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。④硅溶膠：如Percoll。⑤蛋白質：如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有機物：如氟代碳等。

　　⒉梯度材料的應用范圍

　　⑴蔗糖：水溶性大，性質穩定，滲透壓較高，其最高密度可達1.33g/ml，且由于價格低容易制備，是現在實驗室里常用于細胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細胞的分離。

　　⑵聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相對分子重量為400000，Ficoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細胞包括血細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、鼠肝細胞等。

　　⑶氯化銫：是一種離子性介質、水溶性大，最高密度可達1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類，在離心時形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質粒、病毒和脂蛋白的分離，但價格較貴。

　　⑷鹵化鹽類：KBr和NaCl可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。

　　⑸Percoll：是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮（PVP），滲透壓低，它對生物材料的影響小，而且顆粒穩定，在冷卻和凍融情況下還是穩定的，其粘度高，且在酸性pH和高離子強度下不穩定。它可用于細胞、細胞器和病毒的分離。

　　三、分析性超速離心

　　與制備性超速離心不同的是：分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結構，而不是專門收集某一特定組份。因此它使用了特殊的轉子和檢測手段，以便連續監視物質在一個離心場中的沉降過程。

　　（一）分析性超速離心的工作原理

　　分析性超速離心機主要由一個橢圓形的轉子、一套真空系統和一套光學系統所組成。該轉子通過一個柔性的軸聯接成一個高速的驅動裝置，此軸可使轉子在旋轉時形成自己的軸。轉子在一個冷凍的真空腔中旋轉，其容納二個小室：分析室和配衡室。配衡室是一個經過精密加工的金屬塊，作為分析室的平衡用。分析室的容量一般為1ml，呈扇形排列在轉子中，其工作原理與一個普遍水平轉子相同。分析室有上下二個平面的石英窗，離心機中裝有的光學系統可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質，可以通過對紫外光的吸收（如對蛋白質和DNA）或折謝率的不同對沉降物進行監視。后一方法的原理是：當光線通過一個具有不同密度區的透明液，在這些區帶的界面上產生光的折射。在分析室中物質沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個折射的透鏡，結果在檢測系統的照相底板上產出一“峰”。由于沉降不斷進行，界面向前推進，故“峰”也在移動，從峰移動的速度可以得到物質沉降速度的指標。圖16-5是分析性超速離心系統的示意圖。

　　（二）分析性超速離心的應用

　　⒈測定生物大分子的相對分子重量測定相對分子重量主要有三種方法：沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中應用最廣的是沉降速度，超速離心在高速中進行，這個速度使得任意分布的粒子通過溶劑從旋轉的中心輻射地向外移動，在清除了粒子的那部分溶劑和尚含有沉降物的那部分溶劑之間形成一個明顯的界面，該界面隨時間的移動而移動，這就是粒子沉降速度的一個指標，然后用照相記錄，即可求出粒子的沉降系數。

　　分子或粒子的相對分子重量則可從Svedberg方程式來確定：

圖16-5　分析性超速離心系統圖示

　　式中M：該分子不含水的相對分子重量；R：氣體常數；T：絕對溫度；S：分子的沉降系數；ν：分子的微分比容（當一克溶質加到一個大體積的溶液中所占有的體積）；ρ：溶劑的密度。

　　⒉生物大分子的純度估計靜分析性超速離心已廣泛地應用于研究DNA制劑、病毒和蛋白質的純度。用沉降速度的技術來分析沉降界面是測定制劑均質性的最常用方法之一，出現單一清晰的界面一般認為是均質的，如有雜質則在主峰的一側或二側出現小峰。

　　⒊分析生物大分子中的構象變化分析性超速離心已成功地用于檢測大分子構象的變化，例如DNA可能以單股或雙股出現，其中每一股在本質上可能是線性的，也可能是環狀的，如果遇到某種因素（溫度或有機溶劑）DNA分子可能發生一些構象上的變化，這些變化也許可逆、也許不可逆，這些構象上的變化可以通過檢查樣品在沉降速度上的差異來證實。